In un post precedente, abbiamo riassunto brevemente i risultati dello studio di Zurigo, condotto dal gruppo di ricerca di immunologia clinica del Prof. Onur Boyman, sull'attivazione del sistema del complemento nel Long COVID. In questa intervista all'autore principale, Carlo Cervia-Hasler, abbiamo approfondito i risultati e le loro implicazioni.
Dott. Carlo Cervia-Hasler
Innanzitutto, un breve riassunto dello studio
113 persone che avevano contratto la SARS-CoV-2 e 39 controlli sani non infetti sono stati osservati per un periodo di un anno. Dopo 6 mesi, 40 persone mostravano sintomi di Long COVID.
I campioni di sangue dei partecipanti allo studio sono stati analizzati per >6500 proteine diverse tramite tecniche di proteomica. La proteomica può essere utilizzata per un’analisi completa di un proteoma (l'insieme di tutte le proteine presenti in una cellula, un tessuto o un organismo). È possibile così identificare, quantificare e caratterizzare le proteine, ottenendo informazioni sulla struttura, le funzioni e le interazioni delle proteine. Attraverso metodi di tipo quantitativo è possibile, inoltre, determinare i livelli di espressione delle proteine e riconoscere i modelli. Ciò consente di verificare l'attivazione o l'inibizione di determinati meccanismi.
L'obiettivo dello studio era quello di individuare i meccanismi e i modelli di espressione delle proteine che variano tra le persone affette da COVID, le persone sane e quelle completamente guarite dal COVID.
Nello studio, i pazienti affetti da Long COVID mostravano un’attivazione accentuata del sistema del complemento, che fa parte del sistema immunitario innato. I soggetti sani e guariti invece non presentavano tale attivazione. Alcuni componenti del sistema del complemento variavano tra i pazienti affetti da Long COVID (aumento dei livelli del complesso solubile C5bC6; livelli più bassi di C7 nel complesso terminale del complemento (TCC)). Questi cambiamenti possono provocare danni ai tessuti.
A sua volta, Il danno tissutale comporta un aumento dei livelli di marcatori di danno nel sangue, confermato dall'aumento dei livelli del fattore von Willebrand e dai bassi livelli di antitrombina III. Nei pazienti affetti da Long COVID è stato inoltre osservato un aumento dell'aggregazione piastrinica e rilevata l'attivazione del sistema del complemento classico mediata dagli anticorpi.
In sintesi, sulla base di questi risultati, nei pazienti affetti da Long COVID il sistema del complemento è particolarmente attivo, si verifica un danno tissutale e vi è una disregolazione della risposta anticorpale e della coagulazione del sangue.
Queste conoscenze possono essere molto utili per lo sviluppo di un test biomarcatore per la diagnosi di Long COVID. È importante includere diverse caratteristiche osservate in una misurazione.
Un gruppo di ricerca della Charité mette in discussione i risultati
Il 18 marzo 2024, un gruppo di ricerca della Charité di Berlino ha pubblicato su medRxiv un preprint che mette in discussione i risultati dello studio di Zurigo. Questi risultati non sono ancora stati sottoposti a peer review, l'articolo non è stato quindi ancora esaminato da ricercatori indipendenti.
I ricercatori della Charité criticano allo studio di Zurigo la significativa differenza di età tra i pazienti con Long COVID di 6 mesi (età media 58 anni) rispetto alle persone del gruppo di controllo (età media 35 anni) e che i pazienti avevano un indice di massa corporea (BMI) più elevato rispetto al gruppo sano. Analizzando un sottogruppo di partecipanti allo studio, la cui età e il cui IMC erano simili, non è stata riscontrata alcuna attivazione significativa del sistema del complemento.
Gli autori dello studio di Zurigo accolgono con favore le indagini condotte dal gruppo della Charité sul sistema del complemento e sottolineano l'importanza del dialogo scientifico e degli studi di replica.
Tuttavia, sottolineano che il gruppo di Berlino ha utilizzato solo uno dei metodi proteomici (la spettrometria di massa), mentre i risultati principali dello studio di Zurigo si basano su un altro metodo proteomico (la tecnologia SomaScan). I diversi metodi di proteomica presentano punti di forza differenti: mentre la spettrometria di massa può misurare la quantità totale dei singoli componenti del complemento, la tecnologia SomaScan può misurare la quantità dei complessi del complemento e del C7 totale.
Questa differenza metodologica è stata descritta nello studio di Zurigo e ora confermata anche dalla Charité. Gli autori dello studio di Zurigo sottolineano inoltre che nella loro analisi sono state prese in considerazione le differenze di età e BMI tra i pazienti di Long COVID e il gruppo di controllo. Questi fattori da soli non potrebbero spiegare i cambiamenti osservati nel sistema del complemento.
Nel frattempo, sono stati pubblicati ulteriori studi che descrivono l'attivazione del complemento nel Long COVID. I risultati della Charité sottolineano l’importanza di definire cosa misurare e il metodo di misurazione più adatto nello studio del funzionamento di un sistema del complemento. Nel complesso, queste pubblicazioni mostrano come valga la pena approfondire il sistema del complemento nel contesto del Long COVID.
Numero e distribuzione dei partecipanti allo studio
Domande sul disegno dello studio:
Come sono stati selezionati i partecipanti, in particolare il gruppo di controllo?
Il reclutamento dei partecipanti è iniziato nella primavera del 2020. Le persone con un'infezione da SARS-CoV-2 confermata dal test PCR e le persone che non avevano mai avuto un'infezione da SARS-CoV-2 sono state sottoposte a un controllo clinico con prelievo di sangue all'inizio dello studio, a 6 mesi e a 12 mesi.
Tra le persone aventi avuto un'infezione acuta da SARS-CoV-2, c'erano sia casi lievi che gravi, comprese persone che hanno subito un ricovero in ospedale a causa dell'infezione.
La selezione dei partecipanti nel 2020 ha garantito che le persone infette fossero tra le prime. Attraverso un test degli anticorpi, è stato inoltre possibile garantire che le persone sane non fossero mai entrate in contatto con il SARS-CoV-2.
Questi dati sono quindi particolarmente preziosi. Una selezione analoga non sarebbe più possibile, non essendoci quasi più persone per le quali si possa escludere una precedente infezione dal SARS-CoV-2. Dato che i test non vengono più eseguiti, molte persone non sanno più quante volte abbiano avuto il COVID.
I partecipanti allo studio sono stati osservati a partire dall'infezione acuta o, nel caso del gruppo di controllo, dal risultato negativo del test. Sono state quindi escluse le persone del gruppo di controllo che si sono infettate durante il periodo di osservazione. In questo modo è stato possibile determinare chiaramente coloro che avessero sviluppato i sintomi del Long COVID a seguito dell'infezione da SARS-CoV-2 e chi no.
La gravità dei sintomi del Long COVID è variata a sufficienza tra le persone reclutate nello studio da poter generalizzare i risultati a tutti i tipi di pazienti?
I pazienti inclusi coprono l'intero spettro, da una gravità lieve a una elevata. Tuttavia, date le dimensioni contenute dello studio (40 pazienti con Long COVID), possibilmente alcuni livelli di gravità non sono stati coperti. A tale scopo, sarebbe necessario testare un numero maggiore di persone.
Le persone affette da Long COVID con un decorso asintomatico durante l'infezione acuta mostrerebbero lo stesso modello di espressione proteica?
Sebbene i partecipanti allo studio includessero persone con un decorso asintomatico, nessuna di queste ha sviluppato il Long COVID. Non possiamo quindi fare alcuna dichiarazione in merito. Tuttavia, questo aspetto sarebbe sicuramente interessante da esaminare in futuro. Sarebbe anche interessante analizzare l’eventuale associazione di vari decorsi della malattia di Long COVID, a diversi modelli di espressione delle proteine. Il nostro studio non ha ancora evidenziato differenze.
La coorte in esame è sufficientemente ampia per trarre conclusioni significative o è necessaria una ripetizione con un numero maggiore di partecipanti (studio di validazione)?
Uno studio di validazione è certamente necessario e stiamo anche lavorando in collaborazione con partner per confermare i nostri risultati su scala più ampia.
Quale sarebbe una dimensione adeguata dello studio o quale numero di partecipanti sarebbe appropriato?
Non esiste un "numero d'oro", l'importante è che venga condotto un ulteriore studio in un gruppo indipendente di persone affette/controlli. Per quanto riguarda il numero desiderato, più è alto meglio è, pur valutandone la fattibilità; qualche centinaio di campioni sarebbe certamente un buon inizio.
È importante considerare il grado di caratterizzazione della coorte selezionata, ossia quali dati sono noti sui partecipanti allo studio e quale sia il punto temporale preso in esame, ossia dopo quanto tempo dall'infezione sia stato effettuato il test.
Per gli studi sul lungo termine, sarebbe anche importante effettuare misure in momenti successivi. Questo permetterebbe di studiare eventuali cambiamenti nel tempo del modello di espressione della proteina e se i sintomi persistono. Ciò potrebbe fornire informazioni importanti su quando sia possibile effettuare una diagnosi utilizzando i biomarcatori trovati.
Per un eventuale test diagnostico, è necessario verificare se i risultati cambiano nel tempo. Finora lo studio pubblicato ha considerato il periodo a 6 mesi, ma sono stati prelevati campioni anche dopo 12 mesi, che hanno mostrato risultati simili. Abbiamo anche esaminato coloro che presentavano ancora sintomi simili a Long COVID ad un mese dall'infezione acuta, ma non più dopo 6 mesi. Queste persone non hanno mostrato il caratteristico pattern di espressione proteica osservato nei soggetti affetti da Long COVID.
Nel primo studio abbiamo approfondito l'analisi delle proteine nei campioni di sangue. Ora che sappiamo cosa stiamo cercando, possiamo analizzare in uno studio di validazione. Più campioni in meno tempo.
La combinazione di questi 4 biomarcatori è stata in grado di determinare in modo affidabile se un paziente è affetto da Long COVID nello studio di Zurigo.
L'importanza dei risultati dello studio:
Quanto è grande la differenza nei livelli di C7 nel gruppo Long COVID a 6 mesi rispetto ai controlli?
La differenza è molto evidente. Soprattutto perché non stiamo osservando un singolo parametro, ma una combinazione di più parametri. Questo ci permette di distinguere chiaramente tra i soggetti affetti da Long COVID e le persone sane/genitoriali su base proteica. Nello studio, abbiamo costruito il modello di previsione sui risultati di alcuni partecipanti allo studio e lo abbiamo poi testato sugli altri partecipanti. La compatibilità è risultata molto alta. Il modello è stato infatti in grado di determinare chiaramente chi avesse il Long COVID e chi no.
La differenza è abbastanza netta da escludere i falsi negativi quando si utilizzano questi parametri per un test biomarcatore?
il numero di falsi negativi ci siano in un test biomarcatore effettivo, basato sui nostri parametri, si potrà dire solo quando il test sarà stato provato e validato nel "mondo reale".
Un gran numero di malattie ha un impatto sulla cascata del complemento. I biomarcatori trovati sono specifici per il Long COVID e potrebbero essere in grado di differenziare il Long COVID da altre malattie con sintomi simili?
Al momento non possiamo dire se modelli di espressione proteica simili possano presentarsi anche in altre malattie, ad esempio post-virali o la ME/CFS. Questo aspetto potrebbe essere approfondito in studi successivi.
Nel nostro studio non c'erano criteri di esclusione per quanto riguarda le malattie di base, cioè i partecipanti allo studio includevano anche persone che soffrivano di altre malattie oltre al Long COVID.
Al momento, tuttavia, la specificità è meno rilevante per chi soffre di Long COVID. Finora non esiste un modo per diagnosticare la malattia sulla base dei biomarcatori presenti nel sangue. Per ora è importante trovare un metodo che consenta una diagnosi affidabile. Solo, in seguito, si potrà verificare la specificità di questo metodo al cento per cento per il COVID.
Potrebbe continuare così:
Qual è il prossimo passo verso un test diagnostico?
Consideriamo il nostro studio come un pezzo del puzzle che può aiutare l’indagine di un meccanismo di base della malattia. D'altra parte, può essere un'indicazione iniziale per lo sviluppo di un test diagnostico e, successivamente, di un possibile intervento terapeutico.
Per entrambe le cose, dipendiamo dal supporto di partner nella ricerca e nell'industria. Stiamo cercando collaboratori adeguati.
Nel frattempo, proviamo a comprendere meglio il meccanismo, ad aggiungere ulteriori misurazioni in altri punti temporali a seguito dell'infezione e cerchiamo di creare nuove coorti per fornire risultati su campioni più ampi di persone affette da Long COVID. Stiamo inoltre lavorando costantemente allo sviluppo tecnico del nostro metodo per rendere più semplici le misurazioni.
Quanto tempo ci vorrebbe per implementare un simile test biomarcatore?
Se riuscissimo a trovare rapidamente dei partner che ci supportino nello sviluppo e se lo sviluppo del test diagnostico avvenisse in modo ottimale, ci vorrebbero comunque almeno 2 anni prima che il test sia pronto. La rapidità con cui il test entrerà nella pratica clinica quotidiana dipende anche dagli ospedali e dalle cliniche.
Come si può scoprire se esiste una relazione causale tra i biomarcatori trovati e i sintomi (cioè se i biomarcatori sono la causa dei sintomi)?
Per scoprire se esiste una relazione causale, sarebbe necessario condurre un gran numero di esperimenti di modellizzazione. Un meccanismo specifico viene prima studiato in vitro. Ciò significa che il comportamento delle proteine bersaglio (in questo caso il sistema del complemento) viene osservato in cellule prodotte artificialmente.
Se gli esperimenti in vitro confermano le ipotesi, si possono effettuare ulteriori esperimenti in organismi modello viventi, per esempio i topi. Tuttavia, dimostrare una relazione causale è molto complicato e può richiedere diversi anni di ricerca.
Nella ricerca si distingue tra esperimenti in silico, in vitro, ex vivo e in vivo. Gli esperimenti in silico sono calcoli e considerazioni teoriche che possono valutare la probabilità di determinati meccanismi. Negli esperimenti in vitro, un'ipotesi viene testata in colture cellulari coltivate sinteticamente. Negli esperimenti ex vivo, i processi da studiare vengono osservati in tessuti prelevati da un organismo modello e, infine, negli esperimenti in vivo, il processo in questione viene osservato in un organismo modello vivente.
Esistono già farmaci che agiscono sul sistema del complemento. Secondo lei, quanto sarebbe utile testare un farmaco di questo tipo per un trattamento sistemico che affronti tutti i sintomi del Long COVID in studi clinici?
I farmaci che agiscono sul sistema del complemento possono avere effetti collaterali pericolosi. Riducendo l’attività del sistema del complemento, una parte del sistema immunitario viene disattivata, aumentando così in modo significativo la suscettibilità a certe infezioni. Occorre quindi valutare attentamente se i potenziali benefici siano superiori ai rischi.
Sarebbe comunque molto interessante testare un farmaco noto con un effetto sul sistema del complemento in uno studio clinico ben controllato.
Ringraziamo Carlo Hasler-Cervia per l'interessante intervista e ci congratuliamo con lui e i suoi colleghi per il lavoro dello studio. Non vediamo l'ora di conoscere ulteriori sviluppi!
